MỞ ĐẦU I. KHÁI NIỆM Công nghệ Sinh học (CNSH) (Biotechnology) đòi hỏi sự tập hợp của trí tuệ, kỹ thuật dựa trên nền tảng cơ bản của khoa học sự sống. Đó là kết quả của việc ứng dụng những nguyên lý khoa học và công nghệ để chế tạo, sản xuất nguyên vật liệu bằng những tác nhân sinh học, nhằm tạo ra hàng hóa và dịch vụ phục vụ con người. Công nghệ Sinh học trên người và động vật (CNSH N&ĐV) là những kỹ thuật CNSH tiến hành hoặc ứng dụng trên đối tượng người và động vật. Ở nước ta, CNSH trên người chưa thực sự phát triển thành một lĩnh vực độc lập, nên thường được gọi chung là Công nghệ Sinh học Động vật (CNSH ĐV). CNSH ĐV có lịch sử tiềm tàng lâu dài, các kiến thức và sự ứng dụng sơ khai đã diễn ra cách đây 8.000 năm ở khu vực Tây Bắc Á, khi con người lần đầu tiên biết săn bắt các loài động vật hoang dại về nuôi để lấy thịt, lông, sữa…và sau đó thuần hóa chúng làm phương tiện vận chuyển. Cách đây nhiều thập niên, con người đã có nhiều cải tiến mạnh mẽ trong chăn nuôi động vật, biết chọn lọc những cá thể khỏe mạnh, tiêm chủng để phòng ngừa bệnh, thực hiện nhiều kỹ thuật khác để tăng cường khả năng sinh sản của chúng. Tuy nhiên, CNSH ĐV hiện đại (dựa trên thành tựu tế bào học và di truyền học) chỉ thật sự bắt đầu vào những năm 60 của thế kỉ XX và bùng nổ trong hai thập kỷ gần đây. II. NỀN TẢNG KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT II.1. GENOMICS VÀ BỘ GEN NGƯỜI II.1.1. Genomics Genomics là lĩnh vực nghiên cứu về thành phần, tổ chức, chức năng và tiến hóa của thông tin di truyền chứa trong bộ gen. Ba lĩnh vực chính của genomics: hệ gen cấu trúc (structure genomics), hệ gen chức năng (functional genomics), hệ gen so sánh (comparative genomics). Genomics được xem là tâm điểm của sinh học, bởi mọi kết quả từ nghiên cứu genomics đã, và đang đóng góp tích cực vào các lĩnh vực ứng dụng như chăm sóc sức khỏe con người, nông nghiệp, lâm nghiệp và nhiều lĩnh vực khác. Sự phát triển nhanh chóng của genomics có sự trợ giúp của các ngành khoa học kỹ thuật khác, chẳng hạn các thiết bị giải trình tự… Ngoài ra, sự “đua nhau” giải mã bộ gen các sinh vật từ những năm 1990 với nhiều quy mô, nhiều mức độ khiến công việc này trở nên sôi động. Đến nay, có trên dưới 100 loài được giải mã bộ gen. II.1.2. Bộ gen người Ý tưởng giải trình tự cả bộ gen người được đưa ra từ các cuộc họp được tổ chức vào những năm 1984-1986 bởi Cơ quan Năng lượng Mỹ (U.S. Department of Energy). Chương trình được khai trương khi Cơ quan Năng lượng và Viện sức khỏe Mỹ kết hợp. Vào cùng thời điểm này, việc giải trình bộ gen người cũng được bắt đầu ở Pháp, Anh và Nhật bản. Với xu hướng này, việc thành lập Tổ chức Bộ gen Người (Human Genome Organisation_HUGO) vào mùa xuân năm 1988, đã kéo theo một số quốc gia khác cùng tham gia chương trình và có đóng góp vào kế hoạch này, đặc biệt là Đức và Trung Quốc. 1 Tháng 6-1988, cuộc họp quan trọng về việc giải trình tự và lập bản đồ bộ gen (Genome Mapping và Sequencing Meeting) đầu tiên được tổ chức tại Cold Spring Harbor đã chứng kiến nỗ lực của kế hoạch giải trình tự bộ gen người của Celera Genomics (nhóm thứ hai giải trình tự bộ gen người do Craig Venter chủ trì). Cuộc họp được xem như là một điểm nhấn ban đầu cho HGP. Nhờ sự phát triển, hợp tác quốc tế, nhờ tiến bộ của genomics, cũng như kỹ thuật máy tính, bản phác thảo hành động (working draft) bộ gen người đã được hoàn thành vào 26/6/2000. Tháng 2/2001, các phân tích của bản phác thảo hành động được công bố. Dự án bộ gen người hoàn thành và tuyên bố kết thúc vào ngày 14/4/2003, sớm hơn 2 năm ở Hội nghị khoa học của NIH kỉ niệm 50 năm chuỗi xoắn kép DNA. Tháng 5-2006, trình tự của NST người cuối cùng được công bố trên tạp chí Nature. Mặc dù hầu hết các bài báo đều cho rằng bộ gen người đã hoàn thành, thật ra đến năm 2006, nó vẫn còn chưa hoàn tất và sẽ mất nhiều năm nữa mới có thể hoàn thành trọn vẹn, bởi các vùng trung tâm của mỗi NST (như centromere) luôn bao gồm các trình tự DNA lặp lại cao, rất khó có thể giải trình tự chúng với kỹ thuật hiện nay. * Ứng dụng và triển vọng của việc nghiên cứu bộ gen người Các kỹ thuật và công nghệ mới, các tiền đề được tạo ra từ HGP, và những nghiên cứu genomics khác, đang có nhiều tác động mạnh lên khắp các ngành của khoa học sự sống. Một số ứng dụng hiện tại và tiềm năng của việc nghiên cứu bộ gen: - Thuốc phân tử (Molecular medicine). - Các nguồn năng lượng và các ứng dụng môi trường. - Đánh giá rủi ro. - Sinh khảo cổ, nhân loại học, tiến hóa và sự di cư người. - DNA pháp y (DNA forensic). - Nông nghiệp, sinh sản vật nuôi và chế biến sinh học. II.2. PROTEOMICS II.2.1. Khái niệm Proteomics là khoa học nghiên cứu proteome. Proteome là toàn bộ các protein được biểu hiện bởi cả genome. Vì một số gen mã hóa cho nhiều protein khác nhau, nên kích thước của proteome thường lớn hơn so với số lượng gen. Thỉnh thoảng khái niệm này còn sử dụng nhằm để mô tả toàn bộ protein được biểu hiện ở một tế bào, hay một mô đặc biệt nào đó. II.2.2. Các công cụ của proteomics Công cụ đầu tiên của proteomics là dữ liệu. Các dữ liệu protein, EST và trình tự bộ gen được thu thập tạo ra mục lục các protein được biểu hiện trong sinh vật. Chẳng hạn, dựa vào các phân tích tất cả trình tự mã hóa của Drosophila, người ta thấy có đến 110 gen Drosophila mã hóa cho các domain giống EGF, và 87 gen mã hóa cho các protein với các domain xúc tác tyrosine kinase. Theo đó, khi tiến hành proteomics ở loài này, cần có một bản liệt kê các protein đã biết, nếu nghiên cứu gặp phải các thông tin giới hạn, hay các dữ liệu từ phương pháp khối phổ không rõ ràng, người ta có thể xác định thành phần protein từ sự trùng khớp với dữ liệu đã có sẵn này. 2 Công cụ thứ hai là khối phổ (Mass spectrometry_MS). Các thiết bị MS có nhiều thay đổi trong thập niên qua, đặc biệt là độ nhạy. MS có thể thực hiện ba kiểu phân tích rất cần thiết cho proteomics. Thứ nhất là, MS cung cấp sự đo lường chính xác khối lượng phân tử của một protein nguyên vẹn như 100 kDa hay hơn. Do đó, phân tích MS có thể là cách tốt nhất để xác định khối lượng phân tử (hơn cả phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide). MS cũng cung cấp sự đo khối lượng chính xác các peptide từ quá trình protolytic. Dữ liệu từ các peptide này được tìm kiếm trực tiếp, nhằm xác định chính xác protein mục tiêu. Cuối cùng, phân tích MS cũng cung cấp các trình tự của peptide từ quá trình thủy giải. Các dữ liệu từ MS sẽ cung cấp chiến lược rõ ràng (và mạnh nhất) trong việc xác định protein. Công cụ thứ ba là các phần thu gom, kết hợp các dữ liệu MS với các trình tự protein đặc biệt có sẵn trong cơ sở dữ liệu. Các phần mềm này sẽ lấy các dữ liệu MS không được giải thích rõ ràng và kết hợp nó với những trình tự ở cơ sở dữ liệu protein, hay EST và trình tự bộ gen với các thuật toán đặc biệt. Khía cạnh mạnh nhất của những công cụ này, là chúng cho phép tự động hóa được một lượng lớn các dữ liệu MS, cho các kết hợp trình tự protein khác nhau. Công cụ cần thiết thứ tư là kỹ thuật phân tách protein. Sự phân tách các protein có hai mục đích trong proteomics. Thứ nhất, chúng làm đơn giản các hỗn hợp protein thành các protein đơn lẻ hay các nhóm nhỏ. Thứ hai, bởi chúng cho phép phát hiện các khác biệt trong các mức độ protein so sánh giữa hai mẫu, nên kỹ thuật phân tách, nhằm phân tích protein sẽ cho phép người tiến hành xác định được các protein đặc biệt. Thông thường, phương pháp điện di protein hai chiều (2D-SDSPAGE) được sử dụng trong proteomics. Một số kỹ thuật khác cũng được sử dụng là 1D-SDSPAGE, hay sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatograph_HPLC), các kỹ thuật chạy điện di mao quản (Capillary electrophoresis_CE), sắc ký ái lực… II.2.3. Các ứng dụng của proteomics Kỹ thuật proteomics thật sự có tác động lớn với bốn ứng dụng chính. Khai thác (Mining): xác định các protein có trong một mẫu từ cơ sở dữ liệu gen. Ghi nhận sự biểu hiện đặc biệt (Protein-expression profiling): xác định các protein trong một mẫu đặc biệt, cũng như chức năng của một trạng thái đặc biệt của tế bào hay cơ thể (trạng thái biệt hóa, trạng thái phát triển, trạng thái bệnh…), hay chức năng của sự tiếp xúc với thuốc, các kích thích hóa lý. Lập các sơ đồ mạng lưới protein (Protein-network mapping): xác định phương thức các protein tương tác với nhau trong các hệ thống sống. Lập bản đồ các biến đổi protein (Mapping of protein modification): xác định phương thức và vị trí các protein bị biến đổi. II.3. CYTOMICS Cytomics là nghiên cứu các quá trình sinh hóa, nhằm kết hợp các cơ chế ở mức thấp hơn vào các quá trình ở mức tế bào và cuối cùng là cơ thể. Cytomics giúp hiểu và tái thiết lập các quá trình chuyển hóa (genome, proteome, metabolome), mô phỏng tế bào và các cơ thể nhỏ. Phân tích các quá trình chuyển hóa nội bào, metabolome, giúp hiểu được mạng lưới protein, và sự hiện diện các gen im lặng (silent gene). 3 II.4. CÔNG NGHỆ NANO VÀ MICRO Công nghệ nano liên quan đến khả năng sắp xếp các phân tử và các nguyên tử thành các cấu trúc phân tử. Nó có tác động chính lên máy tính, các vật liệu và sự sản xuất các công cụ, thiết bị, khả năng can thiệp vào các cấp độ điều trị bệnh. Các kỹ thuật thiết kế máy micro đang phát triển nhanh chóng và có nhiều ứng dụng trong các vi dòng (microfluidic), các trong sensor, sợi quang học... Các microrobot và nanorobot hoạt động như các robot di động nhỏ trong dịch cơ thể là công cụ tuyệt vời cho các thao tác tế bào. Sự ra đời của biochip là một tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học nano, chúng chứa đựng một phạm vi rộng các vấn đề nghiên cứu như genomics, proteomics, sinh học máy tính và dược học, cũng như một số hoạt động khác. Những tiến bộ trong lĩnh vực này tạo ra những phương pháp mới, gỡ rối cho những quá trình sinh hóa xảy ra trong tế bào, với mục đích là tìm hiểu và chữa trị các căn bệnh cho người. Các biochip được xem là các phòng thí nghiệm thu nhỏ, bởi lẽ trên nó có thể tiến hành hàng trăm đến hàng ngàn phản ứng sinh hóa. Biochip giúp các nhà nghiên cứu có thể sàng lọc nhanh một lượng lớn các chất sinh học với nhiều mục đích khác nhau, từ chẩn đoán bệnh đến phát hiện các tác nhân nguy hại sinh học. II.5. KỸ THUẬT TẾ BÀO ĐỘNG VẬT IN VITRO Việc các tế bào động vật có thể nuôi cấy, duy trì và tăng sinh trong các chai, lọ ngày càng dễ dàng hơn trong phòng thí nghiệm, đã mở ra hướng mới quan trọng trong nghiên cứu CNSH N&ĐV- đó là công nghệ tế bào động vật. Các dòng tế bào cũng được thiết lập, đây là mô hình in vitro lý tưởng cho các nghiên cứu nói chung. Nuôi cấy các tế bào động vật lượng lớn là nền tảng của sản xuất vaccine virus và nhiều sản phẩm công nghệ sinh học khác. Các chất sinh học được sản xuất bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp trong nuôi cấy tế bào động vật như enzyme, hormone, các kháng thể đơn dòng, interleukin…hay các nhân tố kháng ung thư. Mặc dù nhiều protein đơn giản hơn có thể được sản xuất ở vi khuẩn, nhưng nhiều dược chất cần sự glycosyl hóa, điều này hầu như phải được tiến hành trong tế bào động vật. Thu nhận, nuôi cấy và biệt hóa tế bào là một thành công mới trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào động vật. Tuy mới phát triển, nhưng các tế bào gốc (stem cell) đã hứa hẹn nhiều ứng dụng to lớn trong y sinh học. 4 CHƯƠNG 1 NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT I. GIỚI THIỆU I.1. LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào động vật là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các tế bào, mô và cơ quan của động vật nhằm duy trì và/hay tăng sinh các tế bào, mô, cơ quan đó một cách độc lập, tách khỏi những biến đổi của hệ thống in vivo ở điều kiện bình thường hoặc stress. Kỹ thuật này đầu tiên được thực hiện với các mẫu mô, và tốc độ tăng sinh của chúng rất chậm. Việc nuôi cấy mô và tế bào động vật đã được tiến hành hơn 100 năm nay, thông qua những nghiên cứu đầu tiên nhằm tìm hiểu một số vấn đề trong lĩnh vực sinh học phát triển. Chẳng hạn Ross Harrison (1907) đã thành công trong việc nuôi tế bào thần kinh bằng dịch huyết ếch trưởng thành. Alexis Carrel cũng đã nuôi phôi gà trong môi trường bổ sung các chất dinh dưỡng và giữ được tim phôi gà hoạt động đến tháng thứ ba (1912). Năm 1955, Harry Eagle’s khẳng định dịch chiết mô phức tạp, dịch huyết và những chất đang dùng nuôi tế bào có thể được thay bởi “một hỗn hợp các amino acid, vitamin, các co-factor, carbohydrate và muối, bổ sung với một lượng nhỏ protein huyết thanh…”, điều này đã mở ra một thời kỳ mới trong nuôi cấy tế bào động vật in vitro. Sau đó, hàng loạt các kỹ thuật nhằm khai thác, biến đổi và ứng dụng các tế bào động vật nuôi cấy in vitro được tiến hành như tạo các tế bào biến đổi di truyền, nghiên cứu sự chuyển hóa và sinh lý tế bào, thu nhận và tạo dòng in vitro các dòng tế bào bình thường (tế bào sinh dưỡng, sinh dục), và bất thường (tế bào ung thư) của người, cũng như của nhiều động vật khác. Từ một thực tế là những khối u của người có thể tạo nên dòng tế bào liên tục (như dòng tế bào Hela được Gey và cs thiết lập năm 1952), nuôi cấy mô của người đã được đầu tư nghiên cứu. Sau đó, vào năm 1961 Hayflick và Moorhead khảo cứu về các tế bào bình thường có đời sống xác định. Các dòng tế bào đầu tiên đã được thiết lập thành công, chúng duy trì ít nhất một phần đặc điểm, chức năng ban đầu như các tế bào tuyến thượng thận, tế bào tuyến yên, tế bào thần kinh, tế bào cơ... Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô ngày càng tinh vi, hiện đại do nhu cầu bức thiết của hai hướng nghiên cứu chính: tạo vaccine kháng virus và nghiên cứu về ung thư. Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang tiến tới sử dụng dạng tế bào lai (hybridoma) giữa tế bào động vật và tế bào ung thư, như là một hệ thống sản xuất các protein tái tổ hợp, ví dụ kháng thể đơn dòng, vaccine, interferon… Gần đây, nuôi cấy tế bào gốc (stem cell) trở thành mũi nhọn mới trong công nghệ tế bào, với nhiều hy vọng ứng dụng y sinh. I.2. SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Các tế bào động vật có vú là tế bào eukaryote, chúng được liên kết với nhau bởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô. Mô động vật thường được phân chia theo bốn nhóm: biểu mô (epithelium), mô liên kết (connective tissue), mô cơ (muscle) và mô thần kinh (nerve). Trong nuôi cấy tế bào động vật, người ta phân biệt hai nhóm: các tế bào dịch huyền phù và các tế bào dính bám. 5 - Các tế bào dịch huyền phù: là những tế bào không bám dính khi sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy in vitro, ví dụ các tế bào máu và tế bào lympho; những tế bào này không đòi hỏi bề mặt để sinh trưởng. - Các tế bào dính bám: Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám, vì thế chúng cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng (thủy tinh, plastic), được sử dụng phổ biến trong các ứng dụng là các tế bào biểu mô và nguyên bào sợi (fibroblast). Người ta thường sử dụng đĩa petri hoặc các chai trục lăn để nuôi cấy các tế bào dính bám. Các giá thể là polymer bọt biển (spongy), thể gốm (ceramic), các sợi rỗng, microcapsule hoặc các thể mang có kích thước hiển vi (microcarrier) cũng được sử dụng rộng rãi để tăng tỷ lệ diện tích/thể tích trong nuôi cấy. Có một mối quan hệ quan trọng giữa hình dạng tế bào và tính chất bám dính của chúng. Nếu tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy, chúng sẽ có hình dài, trải rộng trên mặt đáy hộp nuôi, ngược lại, nếu không bám dính, tế bào sẽ có hình khối cầu đều. * Đặc điểm của các tế bào động vật - Tế bào động vật không có vách, nhưng kích thước khá lớn (khoảng 10 µm), nên tính bền cơ học yếu. Do đó, tế bào động vật trong nuôi cấy in vitro rất dễ vỡ bởi các lực tác động khi khuấy trộn để tách tế bào, thao tác… Vì vậy, khi thao tác với tế bào động vật, cần cố gắng thao tác nhẹ nhàng và trong thời gian ngắn nhất. - Tế bào động vật có tăng trưởng và phân chia chậm, nên hiệu suất sản sinh các chất có hoạt tính sinh học rất thấp, chậm. Do đó, để sản xuất các chất có hoạt tính từ tế bào động vật, cần phải có thời gian dài và khối lượng tế bào lớn. - Ở tế bào động vật, có cơ chế kìm hãm ngược (negative feed-back), có nghĩa là sự gia tăng nồng độ của một chất nào đó trong môi trường sẽ dẫn đến ức chế tế bào tổng hợp và tiết chất đó ra môi trường. Điều này có thể gây tổn thương tế bào, thậm chí còn có thể làm chết hàng loạt. Vì vậy, khi nuôi cấy mô – tế bào động vật, sau mỗi khoảng thời gian nuôi cấy nhất định, cần thiết phải thay mới môi trường nuôi. - Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Thông thường tế bào tăng trưởng tốt khi gắn vào bề mặt rắn. Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi. Tuy vậy, một số dòng tế bào như tế bào ung thư, hoặc dòng tế bào liên tục từ mô bình thường, sau khi được thuần hóa, có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng mà không cần bám vào nền. - Các tế bào động vật có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình, thông qua quá trình dung hợp hai tế bào có nhân khác nhau tạo thành tế bào lai (hybridoma) hoặc quá trình biến nạp. VD: chủng tế bào bình thường có thể cảm ứng thành tế bào có các tính chất của tế bào ung thư, thông qua quá trình biến nạp được thực hiện bởi một virus cảm ứng ung thư hoặc bằng hóa chất. - Các dòng tế bào động vật có thể được bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng (-197oC) suốt nhiều năm. Khi được giải đông và hoạt hóa, tế bào phục hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như ban đầu. Ngoài các đặc tính trên, tế bào động vật còn có các đặc điểm khác như kém thích nghi với môi trường, nhạy cảm với ion kim loại, và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone… để tăng trưởng và phân chia. Tất cả những đặc điểm trên cần được lưu ý trong quá trình nuôi cấy in vitro. 6 I.3. ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT * Ưu điểm - Hệ thống tế bào động vật là các “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán: như các enzyme, hormone, vaccine, kháng thể đơn dòng, thuốc trừ sâu sinh học, interferon và interleukin, các tế bào nguyên vẹn để thử nghiệm chất độc hóa học… - Các tế bào động vật có quá trình biến đổi hậu dịch mã chính xác (post translational modifications) đối với các sản phẩm protein sinh-dược (biopharmaceutical protein) như phân giải protein, liên kết tiểu đơn vị (subunit), hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác như glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối disulfide hoặc phoshorylation các gốc amino acid. Những sửa đổi này rất quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của sản phẩm. Ví dụ quá trình glycosylation có thể giúp bảo vệ protein chống lại sự phân giải chúng, duy trì khả năng ổn định cấu trúc và biến đổi kháng nguyên. - Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen nhằm chữa trị nhiều bệnh như ung thư, HIV, viêm khớp, các bệnh tim mạch và xơ hóa u nang. - Sản xuất các tế bào động vật để dùng như một cơ chất in vitro trong nghiên cứu độc chất học và dược học. - Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các cơ quan thay thế nhân tạosinh học hay các dụng cụ trợ giúp, như: da nhân tạo để chữa bỏng, mô gan để chữa viêm gan, đảo Langerhans để chữa tiểu đường… * Hạn chế Mặc dù tiềm năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, nhưng việc nuôi cấy một số lượng lớn tế bào động vật thường gặp các khó khăn sau: - Tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn tế bào vi sinh vật. - Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật. Vì thế, sản lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn hơn. - Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị vỡ. - Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền. - Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) hơn là một cơ thể đơn vào riêng biệt như vi sinh vật. - Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt. I.4. MỘT SỐ KHÁI NIỆM DÒNG TẾ BÀO - Dòng tế bào (cell line): là thuật ngữ dùng để chỉ một quần thể tế bào giống hệt nhau bắt nguồn từ một tế bào ban đầu. - Dòng tế bào liên tục (continued cell line; established cell line): là dòng tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro qua nhiều thế hệ, và có thể duy trì khả năng phân bào trong một thời gian rất dài, có khi là vĩnh viễn mà không thay đổi đặc tính. Ví dụ: CHO (chinese hamster ovary: tế bào 7 buồng trứng chuột Trung quốc), Schneider-2 (tế bào phôi ruồi giấm), COS1 (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi), Hela (tế bào ung thư cổ tử cung người), Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi)... - Dòng tế bào tạm thời (temporary cell line): là dòng tế bào chỉ sống trong điều kiện nuôi cấy ở một thời gian giới hạn. Đây thường là các dòng tế bào thường (không phải ung thư). - Tế bào sơ cấp (primary cell): là các tế bào được nuôi cấy trong điều kiện in vitro lần đầu tiên (nuôi cấy sơ cấp) sau khi được tách ra từ khối mô. - Tế bào thứ cấp (secondary cell): là các tế bào đã qua vài lần cấy truyền (nuôi cấy thứ cấp) sau khi được tách từ khối mô. I.5. CÁC CẤP ĐỘ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Nhìn chung, trong phòng thí nghiệm thường có ba cấp độ chính: nuôi cấy cơ quan, nuôi cấy mô phát triển sơ cấp và nuôi cấy tế bào. I.5.1. Nuôi cấy tế bào Tế bào trong điều kiện in vitro có những điểm khác biệt so với in vivo. Thứ nhất là tế bào nuôi cấy in vitro không có đặc tính tương tác tế bào chuyên biệt (tương tác đa chiều) như mô của tế bào in vivo. Thứ hai là môi trường in vitro thiếu vài thành phần liên quan đến sự điều hòa in vivo, do đó chuyển hóa của tế bào in vitro ổn định và dễ kiểm soát hơn trong in vivo, nhưng có thể không thực sự đại diện cho mô. Tuy nhiên, dù thế nào đi nữa thì nuôi cấy mô – tế bào động vật cũng đã thể hiện nhiều khả năng đặc biệt trong nghiên cứu và ứng dụng, nó đã và đang là công cụ rất hữu ích. Có nhiều hình thức nuôi cấy khác nhau tùy đặc tính tế bào, hay tùy thuộc vào phương pháp: nuôi cấy sơ cấp (Primary culture), nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture), nuôi cấy huyền phù (Suspension culture) và nuôi cấy lớp đơn (Monolayer culture). Nuôi cấy sơ cấp: là nuôi cấy các tế bào sau khi được tách ra từ cách mảnh mô và trước lần cấy chuyền đầu tiên. Nuôi cấy sơ cấp thường được sử dụng để khai thác các tế bào ban đầu trong những mảnh mô, nhằm tạo ra các dòng tế bào mới. Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là một hỗn hợp các dòng khác nhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bào quan tâm và những tế bào khác (tế bào nhiễm). Có thể loại bỏ các tế bào nhiễm bằng cơ học, hay enzyme khi tách mô, hay bằng cách duy trì các điều kiện chọn lọc dương tính cho sự sống sót của một kiểu tế bào quan tâm cần thu nhận. Quy trình nuôi cấy sơ cấp: thu nhận các mảnh sinh phẩm, các mảnh mô sống
xử lý sơ bộ, loại bỏ vi khuẩn, nấm và các thành phần không mong muốn khác
tách tạo huyền phù tế bào đơn
đưa vào môi trường nuôi cấy. Nuôi cấy thứ cấp được tiến hành sau khi tế bào được tạo dòng từ nuôi sơ cấp. Nhiều dòng tế bào đã được thiết lập và thương mại hóa. Phần lớn các dòng này được thu nhận từ khối u (ví dụ tế bào Hela, RD…) hay từ các tế bào bị biến đổi in vitro. Tuy nhiên, các dòng tế bào này được nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm khác nhau nên có thể dẫn đến sự phát sinh các đặc tính mới khác nhau và khác với các tế bào sơ khai ban đầu. Các tế bào nuôi cấy thứ cấp là đối tượng chính cho nghiên cứu và ứng dụng của công nghệ tế bào động vật. Quy trình nuôi cấy thứ cấp: giải đông (đối với các tế bào được bảo quản lạnh)
đưa vào môi trường thích nuôi cấy thích hợp 8 Nuôi cấy huyền phù thường được tiến hành với các tế bào thu nhận từ máu (bạch cầu…). Có thể coi đây là phương pháp nuôi cấy trong không gian ba chiều với kỹ thuật nhân sinh khối bằng fermenter, thông qua hệ thống bioreactor, nhằm thu nhận lượng lớn các tế bào mong muốn. Nuôi cấy lớp đơn được ứng dụng với những dòng tế bào khác thu nhận từ các mô rắn (phổi, thận, cơ, xương, mỡ…) cần nuôi phát triển thành lớp đơn. Các dòng tế bào bám dính có thể được phân loại như tế bào nội mô: BAE-1; tế bào biểu mô: Hela; mô thần kinh: SH-SY5y hay fibroblast: MRC-5. Thông thường, hình dạng in vitro của các tế bào sống nói trên luôn phản ánh nguồn gốc của mô. Ngoài ra, một số dòng tế bào khi nuôi sẽ biểu hiện trạng thái bán bám dính (semi-adheret) như B95-8. Khi đó, trong dụng cụ nuôi sẽ xuất hiện hỗn hợp hai quần thể tế bào: các tế bào bám và các tế bào huyền phù. * Những thuận lợi của nuôi cấy tế bào - Có thể phát triển một dòng tế bào qua nhiều thế hệ. - Có thể nuôi cấy ở quy mô lớn. * Những bất lợi của nuôi cấy tế bào - Tế bào bị mất đi một số đặc tính đã biệt hóa trong mô. I.5.2. Nuôi cấy mô Nuôi cấy mô phát triển sơ cấp được tiến hành bằng cách đặt các mảnh mô lên trên bề mặt rắn bằng nhựa, hay thủy tinh bao phủ bởi các chất dinh dưỡng dạng lỏng. Trong điều kiện thích hợp, các mảnh mô sẽ bám vào bề mặt rắn, các tế bào ở phần rìa của mảnh mô sẽ tăng sinh làm nới rộng mảnh mô. Kỹ thuật này cung cấp mô hình thử nghiệm thuận lợi hơn so với các thử nghiệm in vivo, đặc biệt khi tiến hành các nghiên cứu về độc tố. Nuôi cấy mô phát triển sơ cấp còn dùng để thu nhận các quần thể tế bào. * Những thuận lợi của nuôi cấy mô - Các yếu tố lý hóa của môi trường (pH, nhiệt độ, áp suất thẩm thấu, O2, CO2) được kiểm soát tốt. Các yếu tố bổ sung có thành phần không xác định cũng đang dần được hiểu rõ và được thay thế bởi những thành phần xác định. - Mẫu mô không đồng nhất nhưng sau vài thế hệ nuôi cấy in vitro, những dòng tế bào này trở nên đồng nhất hơn hay ít nhất là cùng dạng. - Những tế bào nuôi cấy có thể tiếp xúc trực tiếp với một chất ở nồng độ thấp và xác định, và chất này có thể xâm nhập trực tiếp vào tế bào. - So với nuôi cấy cơ quan thì trong nuôi cấy mô, một số chức năng bình thường của mô vẫn được duy trì và có thể nuôi cấy trên quy mô lớn (nhưng khó tiến hành). * Những khó khăn của nuôi cấy mô - Tổ chức ban đầu của mô bị mất. - Kỹ thuật nuôi cấy cần được thực hiện ở điều kiện vô trùng tuyệt đối. Tế bào động vật đòi hỏi được cung cấp một môi trường phức hợp, giống huyết tương máu hay dịch lỏng ở kẽ các tế bào. Do đó, đòi hỏi người thực hiện phải có kỹ năng thành thạo và hiểu biết tốt về lĩnh vực này. - Tiêu hao nhiều công sức và tiền bạc nhưng chỉ thu được một lượng nhỏ. Giá thành việc nuôi cấy cao, do đó chỉ nên sử dụng khi cần thiết. 9 - Sau một thời gian phân chia liên tục, có thể tạo thành các tế bào với bộ NST đa bội không hoàn chỉnh. Ngay cả với nuôi cấy trong thời gian ngắn, mặc dù các tế bào có thể ổn định về mặt di truyền, nhưng sự không đồng nhất về tốc độ tăng trưởng của từng tế bào có thể tạo ra sự thay đổi từ thế hệ này sang thế hệ khác. I.5.3. Nuôi cấy cơ quan Kỹ thuật nuôi cấy cơ quan được phát triển từ các phương pháp nuôi cấy mô nhằm phục vụ nghiên cứu, đây có thể là mô hình chức năng trong nhiều thử nghiệm. Đó là kỹ thuật nuôi cấy in vitro những mảnh của một cơ quan hay cả cơ quan, duy trì cấu trúc của mô và hướng nó phát triển bình thường. Môi trường nuôi cấy cơ quan có thể ở dạng môi trường rắn hay môi trường lỏng. Việc nuôi cấy cơ quan thu nhận từ phôi thai dễ dàng hơn các cơ quan từ cơ thể trưởng thành, bởi nhu cầu O2 của những mô trưởng thành lớn hơn nhiều. Vì vậy, để nuôi được các cơ quan từ cơ thể trưởng thành phải sử dụng môi trường với các thiết bị đặc biệt. Những thuận lợi của nuôi cấy cơ quan: - Chức năng sinh lý bình thường của cơ quan được duy trì. - Tế bào giữ trạng thái biệt hóa hoàn toàn. Những bất lợi của nuôi cấy cơ quan: - Không thể nuôi cấy quy mô lớn. - Cơ quan nuôi cấy phát triển chậm. - Thường xuyên phải cấy chuyền sang môi trường mới cho mọi thí nghiệm. II. ĐIỀU KIỆN LÝ – HÓA TRONG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỘNG VẬT II.1. Nhiệt độ Tế bào của các loài động vật khác nhau có nhiệt độ nuôi cấy thích hợp khác nhau. VD: tế bào của động vật có vú và của người phát triển tốt ở 37 ± 10C, nhiệt độ tế bào của các loài chim phát triển tốt ở 38,50C, còn tế bào của các loài côn trùng phát triển tốt ở nhiệt độ 25 ± 20C. Một số dòng tế bào phát triển ở nhiệt độ thấp hơn thân nhiệt bình thường của cơ thể, VD: tế bào biểu mô, tế bào tinh trùng... Trong nuôi cấy in vitro, tế bào động vật không chịu được nhiệt độ cao hơn 20C so với nhiệt độ phát triển thích hợp của chúng, nhưng tế bào lại có khả năng chịu đựng được nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng mà rất ít ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng sau này. Để duy trì nhiệt độ nuôi cấy, thường phải sử dụng tủ ấm (incubator). Nhìn chung, các tủ ấm duy trì nhiệt độ bằng cách làm ấm và tuần hoàn khí nóng để đáp ứng với những thay đổi nhiệt và sẽ trả lại nhiệt độ nhanh chóng sau khi mở hay đóng cửa tủ. Đối với các tủ ấm có bổ sung nước ở khay bên dưới sẽ duy trì độ ẩm cao. II.2. pH pH không chỉ quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng ion thích hợp mà còn duy trì chức năng tối ưu của các enzyme nội bào, cũng như sự gắn kết của các hormone và nhân tố tăng trưởng lên các receptor bề mặt. Sự biến đổi pH có thể làm thay đổi chuyển hóa tế bào, dẫn tới sự cảm ứng 10