THAO TÁC TRONG PTN NUÔI CẤY VI SINH VẬT (PHẦN 2) Show Cung cấp những kiến thức về kỹ năng thực hành các chỉ tiêu cơ bản trong đánh giá kiểm tra môi trường bằng phương pháp vi sinh vật trong việc phân tích vi sinh trong nước, đất và không khí. Nhận diện các đa dạng của vi sinh vật trong môi trường cùng sự phát triển và ảnh hưởng của chúng. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN VI SINH VẬT
1.1 Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác: - Dán nhãn ghi Tên giống vi sinh vật, Ngày cấy vào thành ống nghiệm, dưới nút bông một chút. - Tay trái cầm 2 ống nghiệm: 1 ống giống, 1 ống môi trường - Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy - Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống giống ra - Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm - Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống. - Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống vào môi trường để thực hiện các thao tác cấy truyền. - Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông - Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong - Chú ý: • Nếu ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút canh trường thay que cấy. • Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ ống hút sau khi đã tháo giấy bao gói. • Sử dụng xong cắm ống hút vào dung dịch crômic để khử trùng. 1.2. Phương pháp cấy trên thạch nghiêng: Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí. - Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên - Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp theo: + Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm. + Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu Hình chữ chi Hình vòng xoắn Hình vạch ngang song song 1.3 Phương pháp cấy trên thạch đứng: Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị khí. - Sử dụng que cấy hình kim - auk hi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ. - Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát thành ống tuỳ yêu cầu. - Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường 1.4. Phương pháp cấy trên đĩa pêtri: Có thể cấy trên đĩa pêtri theo 1 trong 2 cách sau: * Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau: - Để đĩa pêtri lên bàn. - Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở phương pháp chung. - Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào. - Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một trong các kiểu sau: + Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch + Theo những đường song song + Theo 4 hình chữ chi 4 góc * Dùng pipet: Thường áp dụng để định lượng vi sinh vật và cấy một lượng khá nhiều giống. Có 2 cách: - Cách 1: + Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm có môi trường thạch ở nhiệt độ 500 C. + Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường. + Đổ thạch này vào đĩa pêtri đã khử trùng. + Xoay tròn đĩa pêtri cho thạch dàn đều ở đáy hộp. + Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp. - Cách 2: + Hút 0,1 ml dịch cấy, nhỏ vào đĩa pêtri có môi trường đặc. + Dùng que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa. + Cất vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tuỳ loài vi sinh vật. III. Các phương pháp nuôi vi sinh vật : Để đảm bảo sự phát triển của vi sinh vật, sau khi cấy xong phải quan tâm đến các điều kiện nuôi dưỡng chúng. Các điều kiện đó bao gồm: - Nhiệt độ: Tuỳ loài vi sinh vật khác nhau, chọn nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của chúng và duy trì sự ổn định nhiệt độ đó. - Độ ẩm: Để duy trì độ ẩm trong quá trình nuôi cần: - Đảm bảo đủ lượng nước khi làm môi trường. - Trong điều kiện cần thiết có thể phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm. - Ôxi (O2): (i) Đối với vi sinh vật hiếu khí: + Cung cấp thường xuyên và đầy đủ O2. + Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải. + Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxi cho vi sinh vật. + Nếu nuôi cấy trong môi trường có khối lượng lớn phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ. (ii) Đối với vi sinh vật kị khí: Hạn chế sự tiếp xúc với oxi bằng cách; Đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vazơlin; Cấy trích sâu vào môi trường đặc. Nuôi cấy trong bình hút chân không. Nuôi trong ống nghiệm đặc biệt sau khi rút hết không khí và hàn kín lại .Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O2. Để nguội 450C. Dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với O2. - Kết quả của việc nuôi cấy: Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật ta thấy: - Trong môi trường lỏng: Vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường. - Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng: + Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên vệt nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục. + Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy. - Trong môi trường thạch đứng: Các vi khuẩn kị khí phát triển ở đáy của cột môi trường. IV. BẢO QUẢN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT 4.1. Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 1. Phương pháp cấy truyền định kỳ lên môi trường mới: - Phương pháp này áp dụng để bảo quản tất cả các loại vi sinh vật. - Ưu điểm: Phương pháp này đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản không lâu. - Nhược điểm: Tốn môi trường, công sức và thời gian. Phẩm chất ban đầu của giống có thể bị thay đổi do nhiều nguyên nhân khó xác định cụ thể trong quá trình cấy truyền. 2. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng: - Yêu cầu của phương pháp này là sử dụng dầu khoáng như parafin lỏng hay vazơlin phải trung tính, có độ nhớt cao, không chứa các sản phẩm độc với vi sinh vật và vô trùng. - Cách bảo quản: + Khử trùng dầu khoáng bằng cách hấp ở 1200C trong 2h. Sau đó sấy khô ở tủ sấy (1700 C) trong 1 - 2h; để nguội + Đối với vi sinh vật kị khí : + Hạn chế sự tiếp xúc với ôxi bằng cách : * Đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vazơlin * Cấy trích sâu vào môi trường đặc. * Nuôi cấy trong bình hút chân không * Nuôi trong ống nghiệm đặc biệt sau khi hút lên không và hàn kín lại * Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O2. Để nguội 450 C. Dùng ống hút cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với O2. + Đổ lên bề mặt môi trường có vi sinh vật phát triển tốt một lượng dầu cách mép trên ống nghiệm 1 cm. + Dùng parafin đặc hàn kín miệng ống, bình nuôi VSV. - Ưu điểm: Phương pháp này đơn giản nhưng hiệu quả cao nhờ khả năng làm chậm quá trình biến dưỡng và hô hấp nên vi sinh vật phát triển chậm lại. Môi trường không bị mất nước và khô. 3. Phương pháp giữ giống trên đất, cát, hạt * Trên đất, cát: Dùng để bảo quản các chủng tạo bào tử tiềm sinh (hoặc bào tử vô tính) với thời gian bảo quản từ một đến nhiều năm. - Cách bảo quản: + Đất, cát đem rây để lấy hạt đều và ngâm trong HCl hay H2SO4 đậm đặc 8 - 12h để loại bỏ các axit hữu cơ trong cát. + Rửa kỹ và giữ ở điều kiện vô trùng. + Sấy khô và giữ ở điều kiện vô trùng + Đổ đầy cát vào ống nghiệm có vi sinh vật phát triển trên môi trường thạch và lắc thật đều. + Rót toàn bộ cát lẫn vi sinh vật vào 1 ống nghiệm khác. + Hàn kín miệng ống nghiệm này sẽ bảo quản được rất lâu. * Trên hạt: Dùng để bảo quản các chủng có dạng hình sợi sinh bào tử hoặc không. Thời gian bảo quản có thể tới 1 năm. - Cách bảo quản: + Hạt ngũ cốc (lúa, bobo) được rửa sạch. + Nấu cho hạt vừa nứt, để ráo nước. + Cho vào các ống nghiệm các hạt ngũ cốc nói trên. + Phủ trên mặt các hạt này một lớp bông thấm nước nấu hạt ngũ cốc. + Cấy giống vi sinh vật trên lớp bông cho mọc thật dầy. + Giữ ở nhiệt độ 15 – 200 C. 4. Phương pháp đông khô: Phương pháp này làm cho tế bào mất nước ở trạng thái tự do. Đồng thời làm giảm, thậm chí làm ngừng hẳn quá trình phân chia của vi sinh vật. Nhờ đó chúng có khả năng chịu được nhiều tác động của ngoại cảnh. - Phương pháp này dùng nhiều trong sản xuất, thời gian bảo quản lên tới vài chục năm.
Bảo quản chủng vi sinh vật có tầm quan trọng đặc biệt, làm nền tảng cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp và môi trường. Nhiệm vụ quan trọng nhất của Bộ sưu tập chủng vi sinh vật là thu thập, làm giàu các chủng giống vi sinh vật hữu ích và bảo quản chúng theo phương pháp thích hợp. Việc thu thập các chủng vi sinh vật có thể bằng nhiều cách như phân lập, tuyển chọn từ môi trường, trao đổi trong nước và quốc tế. Các chủng vi sinh vật chuẩn phải được định hướng theo từng mục tiêu cụ thể của từng Bộ sưu tập, ví dụ các chủng vi sinh vật chuẩn, các chủng có hoạt tính sinh học và các chủng làm cơ sở cho tra cứu khi nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật. Bảo quản chủng vi sinh vật là công việc không dễ dàng, xuất phát từ mục đích của bảo quản không những là duy trì khả năng sống của vi sinh vật, thuần chủng, tránh tạp nhiễm mà còn đảm bảo tính ổn định di truyền và các đặc tính sinh học trong suốt quá trình bảo quản. Thực tế không có một phương pháp bảo quản nào là vạn năng dùng chung cho các nhóm chủng giống vi sinh vật mà mỗi nhóm vi sinh vật chỉ thích hợp với một vài phương pháp bảo quản nhất định. Các chủng giống vi sinh vật bảo quản sẽ được cung cấp cho người sử dụng do đó nhiệm vụ quan trọng của bộ sưu tập vi sinh vật là thu thập và cung cấp các thông tin quan trọng của chủng vi sinh vật bảo quản cho người sử dụng như: môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, nhu cầu dinh dưỡng, tính an toàn sinh học, tên phân loại v.v..Như vậy yêu cầu đối với cán bộ phụ trách Bộ sưu tập vi sinh vật phải có kiến thức vững về vi sinh vật, di truyền học, sinh hoá học, sinh lý vi sinh vật và bệnh học vi sinh vật để kiểm soát được các đặc tính quan trọng của các vi sinh vật bảo quản. Một số điểm lưu ý đối với một Bộ sưu tập chủng vi sinh vật:
Các phương pháp bảo quản chủng vi sinh vậtTrong phần này, các phương pháp được dùng chung cho các đối tượng vi sinh vật chính (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn, vi tảo). 1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật:Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này như: Staphylococi,Coliform… có thể sống được vài năm theo cách này. Cho dù phương pháp này là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:
* Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản:Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương pháp này các chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như sau:
Nhìn chung, không có phương pháp nào là vạn năng cho bảo quản các nhóm vi sinh vật khác nhau. Thực ra là rất khó khi đánh giá một cách đầy đủ xét theo mọi yêu cầu đã được đặt ra ở trên. Chính vì vậy mà các phương pháp bảo quản phải được kiểm nghiệm thực tế với từng loại vi sinh vật, từ kết quả đó có thể chọn ra phương pháp thích hợp hoặc đồng thời sử dụng các phương pháp khác nhau. 2. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp2.1. Phương pháp đông khô:Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật. 2.2. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying):Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô trực tiếp. Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước. Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn không có khả năng sống trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là:
Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu. Thông thường theo phương pháp này, chủng vi sinh vật được bảo quản từ 10-20 năm. Nói chung cả hai phương pháp này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp trước như thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm được công sức và sai sót nhãn mác và tạp nhiễm. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành thiết bị. Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau. Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi trường thích hợp một số lần để phục hồi các đặc tính sinh học. 3. Phương pháp bảo quản lạnh sâuĐối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì chủng vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C). Xem thêm: Principles of cryopreservation Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C và -196° C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut. Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật. Tuy nhiên, phương pháp lạnh sâu cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ… Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô. Tổng kết: Chúng ta đã đi qua các phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật phổ biến và hiệu quả nhất hiện nay. Đối với đa số Viện và Trung tâm nghiên cứu, kỹ thuật cấy truyền và nuôi cấy vi sinh vật là phổ biến hơn cả. Đối với các công ty và trung tâm kiểm nghiệm, do yêu cầu về tiêu chuẩn chất lượng cao của chủng giống vi sinh vật nên phương pháp đông khô và lạnh sâu thường được ưu tiên triển khai. Mặc dù vậy, tùy thuộc vào nhu cầu và ngân sách cho phép mà mỗi đơn vị sẽ lựa chọn những phương pháp bảo quản vi sinh vật phù hợp để đảm bảo độ tinh sạch và đặc tính sinh học của từng chủng giống chuẩn. Nguồn: Giáo trình Vi sinh vật – GS. Nguyễn Lân Dũng www.chungvisinh.com
|
