Glucose là carbohydrate quan trọng nhất lưu hành trong máu ngoại vi. Quá trình đốt cháy glucose là nguồn chính cung cấp năng lượng cho tế bào. Glucose máu được định lượng theo phương pháp động học có sự tham gia của enzzym hexokinase: HK Glucose + ATP -----> G6P + ADP G6PDH G6P + NADP+ -----> Gluconate-6-P + NADPH + H+ Đo tốc độ tăng mật độ quang của NADPH ở bước sóng 340 nm. II. CHUẨN BỊ 1. Người thực hiện Bác sỹ hoặc kỹ thuật viên được đào tạo chuyên ngành Hóa sinh 2. Phương tiện, hóa chất - Máy móc: hệ thống máy sinh hóa - Thuốc thử: sẵn sàng sử dụng. R 1: buffer, NADP ... R 2: HK, G6PDH... Bảo quản ở 2-8oC đến khi hết hạn sử dụng, 12 tuần khi để trên máy phân tích. Các loại dung dịch hệ thống khác: - Chuẩn, nước muối sinh lý - Control: 2 mức - Vật tư tiêu hao: ống lấy máu, kim tiêm, bông, cồn, găng tay … 3. Người bệnh Được giải thích trước khi thực hiện xét nghiệm, tốt nhất là nhịn ăn sáng và lấy máu vào buổi sáng. 4. Phiếu xét nghiệm Có đầy đủ thông tin về người bệnh bao gồm tên, tuổi, khoa phòng, chẩn đoán, tình trạng mẫu, tên bác sỹ chỉ định, các loại thuốc đã sử dụng (nếu có) … III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 1. Lấy bệnh phẩm Bệnh phẩm phải được lấy đúng kỹ thuật vào ống tiêu chuẩn. Ly tâm trước khi tiến hành kỹ thuật. Có thể sử dụng huyết thanh hoặc huyết tương. Bệnh phẩm phải được ly tâm tách lấy huyết thanh, huyết tương ngay. Bảo quản ở 15-25oC trong vòng 8 giờ, ở 2-8oC được 72 giờ. Rã đông một lần. Để bệnh phẩm, chuẩn, control ở nhiệt độ phòng (20-25oC) và lắc đều trước khi tiến hành xét nghiệm. 2. Tiến hành kỹ thuật - Máy móc, hóa chất đã được cài đặt và chuẩn trước khi thực hiện phân tích. Control nằm trong miền cho phép tùy thuộc vào kỹ thuật, thuốc thử của từng công ty. Thông thường chạy control 2 miền: bình thường và bất thường. Đối chiếu với luật về nội kiểm chất lượng nếu đạt thì tiến hành phân tích mẫu. - Đưa bệnh phẩm vào phân tích theo protocol của máy. Khi có kết quả thì phân tích và đối chiếu với phiếu xét nghiệm và trả kết quả. IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ - Bình thường: + Người lớn: 3.9 – 6.4 mmol/l + Trẻ em: 3.3 – 5.6 mmol/l + Trẻ sơ sinh: 2.2 – 4.4 mmol/l - Glucose máu tăng trong: + Đái tháo đường + Viêm tuỵ, ung thư tuỵ. + U tuỷ thượng thận. + Cường giáp. - Glucose máu giảm trong: + Suy tuyến yên, suy tuyến giáp. + Bệnh Insulinoma. + Thiếu dinh dưỡng.
- Bệnh phẩm để lâu không ly tâm và định lượng ngay gây hiện tượng hủy đường -> Làm giảm kết quả. Sau 1 giờ giảm khoảng 7% -> Sử dụng chất chống đông NaF để tránh hủy đường - Lấy máu sau ăn -> Làm tăng kết quả -> Làm lại mẫu lúc đói - Bệnh phẩm tăng bilirubin, huyết tán, tăng lipid máu, đang sử dụng thuốc -> Kết quả ảnh hưởng không rõ Đây là phương pháp phổ biến với các hóa chất cho máy hóa sinh bán tự động và một số máy hóa sinh tự động. Phương pháp này kết hợp sử dụng emzym glucose oxydase và Peroxydase. Nguyên lý của phương pháp như sau: GOD (glucose oxydase) Glucose + H2O ----> Acid gluconic + H2O2 POD (Peroxydase) 2H2O2+ Phenol + 4 amino-Antipyrin -----> Quinonemin + 4H2O Phương pháp trải qua 2 bước. Đầu tiên glucose trong mẫu được oxy hóa bởi enzym glucose oxydase để tạo H2O2. Tuy nhiên glucose oxydase có đặc hiệu cao với β-glucose trong khi trong huyết thanh còn có cả α-glucose với tỉ lệ 2/3 β-glucose, 1/3 α-glucose, do vậy một số hóa chất còn có thêm cả mutarotase để chuyển α-glucose thành β-glucose. H2O2 được tạo ra tỉ lệ thuận với nồng độ glucose. Sau đó H2O2 tiếp tục tham gia phản ứng với Phenol và 4 amino-Antipyrin để tạo ra Quinonemin. Quinonemin có màu hồng cánh sen, đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ Glucose. Quinonemin được đo ở bước sóng 540nm. Một số phương pháp có thể đo ngay lượng H2O2 được tạo ra mà không cần qua giai đoạn thứ 2 như máy đo đường huyết cầm tay hay máy khí máu. Tại sao ở đây lại sử dụng Phenol và 4 amino-Antipyrin? Mục đích của phản ứng để chuyển: Chất màu dạng khử + H2O2 ----> Chất màu dạng Oxy hóa + H2O Tuy nhiên trong huyết thanh có nhiều chất khử khác như acid uric, vitamin C, bilirubin... sẽ ức chế phản ứng này do cạnh tranh với chất màu trong phản ứng (ví dụ phenol) làm kết quả thấp giả tạo. Do vậy người ta đã cho thêm 4 amino-Antipyrin để loại bỏ nhiễu bởi acid uric, creatinin hoặc hemoglobin.... Ngoài ra cũng cần lưu ý nếu phản ứng bị nhiễm catalase do catalase phân hủy H2O2 . Ưu điểm của phương pháp này là thời gian nhanh và giá thành thấp. Nhược điểm là còn nhiều yếu tố ảnh hưởng tác động đến phản ứng và thường làm giảm nồng độ glucose so với thực tế. 2. Phương pháp hexokinase: Đây là phương pháp phổ biến hiện nay trên các hệ thống máy tự động. Phương pháp này là chính xác nhất hiện nay. Bằng việc sử dụng men Hexokinase nên rất đặc hiệu với glucose mà không bị nhiễu bởi các carbonhydrat khác. Phương pháp trải qua 2 gian đoạn theo sơ đồ sau: Hexokinase Glucose + ATP -------> Glucose-6-Phosphat + ADP G6PD Glucose-6-Phosphat + NADP+ ----> 6-Phosphogluconat + NADPH + H+ Giai đoạn 1: Hexokinase sẽ xúc tác phản ứng phosphoryl hóa glucose tạo Glucose-6-Phosphat. Giai đoạn 2: G6PD sẽ xúc tác phản ứng oxy hóa Glucose-6-Phosphat để tạo NADPH. Mật độ quang của NADPH tăng lên tỉ lệ thuận với nồng độ Glucose và được đo ở bước sóng 340 nm. Cần lưu ý ở đây là Hexokinase xúc tác phản ứng phosphoryl cả fructose và mannose, tuy nhiên nồng độ các loại đường này trong máu là quá nhỏ và không đủ để gây nhiễu cho phản ứng. Một lưu ý nữa là huyết thanh (huyết tương) vỡ hồng cầu có thể ảnh hưởng đến phương pháp này do trong hồng cầu có G6PD và 6-phosphogluconat dehydrogenase mà cả 2 enzym này cũng sử dụng NADP+ làm cơ chất. Do vậy ngày nay để giảm sự ảnh hưởng này người ta sử dụng G6PD của vi khuẩn (thay vì của nấm) vì G6PD của vi khuẩn sẽ sử dụng NAD+ thay thế NADP+ Đồng thời thay vì đo sự thay đổi mật độ quang của NADPH, hiện nay một số hóa chất sử dụng thêm một chất chỉ thị như phenazin methosulphat (PMS) hoặc Idonitrotetrazolium (INT) để tham gia phản ứng với NADPH tạo sản phẩm màu đo được ở bước sóng 520nm. Ưu điểm của phương pháp này là có độ đặc hiệu cao. Kết quả ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác. Nhưng nhược điểm là giá thành hóa chất còn cao. 3. Phương pháp Glucose dehydrogenase (GDH). Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trên các máy đo đường huyết cá nhân. Phương pháp chỉ xảy ra qua 1 phản ứng: GDH β-D-Glucose + NAD+ ------->. D-Glucono-∆-lacton + NADH + H+ NADH tạo ra được đo ở bước sóng 340 nm dưới dạng động học hoặc điểm cuối. Ngoài ra người ta còn cho thêm mutarotase để chuyển các α-Glucose sang β-Glucose giúp kết quả được chính xác hơn. Tuy nhiên men GDH lại cũng phản ứng với các đường khác như maltose, galactose hay xylose. Vì vậy nếu vì một lý do nào đó bệnh nhân có sử dụng các đường này trong điều trị sẽ làm kết quả tăng giả tạo. Để tránh sai số này ngày nay người ta sử dụng loại GDH được phân lập từ chủng vi khuẩn Bacillus cereus rất đặc hiệu với glucose nên sẽ cho kết quả chính xác hơn và tương đương với phương pháp Hexokinase. Trên đây mình đã trình bày 3 phương pháp enzym dùng để định lượng đường (glucose) trong máu. Hy vọng qua bài viết các bạn sẽ hiểu được sâu hơn thêm về nguyên lý cũng như các ảnh hưởng của các phương pháp định lượng glucose. Bài viết có thể còn nhiều thiếu sót mong bạn đọc góp ý thêm. Mọi đóng góp vui lòng phản hồi tại đây. |
